Doutorado em Ciências Médicas pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Financiamento:
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco
Resumo
As Displasias Corticais Focais (DCFs) são cada vez mais reconhecidas como substratos patológicos em pacientes com epilepsia refratária submetidos à ressecção cirúrgica. Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento desta patologia ainda são incertos, acredita-se que anomalias celulares e de arquitetura que ocorrem principalmente durante o desenvolvimento cerebral in útero estejam envolvidos. Alguns estudos sugerem que injúrias perinatais e nos primeiros períodos pós-natais também estão associadas com DCF. O desenvolvimento de modelos animais a fim de mimetizar DCFs já rendeu vários candidatos aos possíveis mecanismos envolvidos na sua epileptogênese. Neste estudo utilizamos o modelo de criolesão pós-natal para mimetizar as alterações corticais encontradas na DCF. Esse modelo animal, no qual o rato desenvolve microsulcos após uma criolesão feita através do crânio no primeiro dia de nascimento (P0), foi introduzido por Dvorak & Feit em 1977. Um microgiro constituído por um córtex de quatro camadas, lembrando as polimicrogirias observadas em humanos, está presente. Atividade epileptiforme interectal pode ser evocada de uma região adjacente ao microgiro, denominada de região paramicrogiral, contudo não são observadas crises espontâneas nestes animais. Segundo Fleiss & Gressens (2012), um dano agudo no SNC leva a uma sustentada inflamação do cérebro prematuro, a qual pode, por sua vez, aumentar os riscos de futuras disfunções cognitivas ou aumentar a vulnerabilidade para uma segunda injúria. Sendo assim, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a resposta inflamatória gerada no córtex cerebral imaturo de animais submetidos à técnica de criolesão, assim como a influência desta lesão na suscetipbilidade do animal criolesado a um segundo estímulo na vida adulta. Para isso sacrificamos animais, criolesados e sham, 24 horas e sete dias após a técnica de criolesão, além de submeter ambos os grupos a uma subdose de pilocarpina (PILO – 270 mg/Kg), para indução de SE, quando adultos. Observamos no córtex frontal dos animais sacrificados 24 horas e sete dias após a técnica de criolesão alterações histopatológicas indicativas de um processo inflamatório local, tais como núcleos picnóticos, aumento do espaço extracelular e vacuolização celular. Este resultado foi corroborado pela presença de células Iba-1 e GFAP positivas, indicando respectivamente micróglias e astrócitos ativados, na área lesionada. Encontramos também células Fluoro Jade positivas, comprovando a ocorrência de morte celular por necrose em resposta a injúria local. Quando adultos, os animais do grupo criolesão apresentaram um microgiro de quatro camadas em seu córtex frontal e, para avaliar a suscetibilidade destes animais a um segundo estímulo, injetamos uma subdose de pilocarpina nos grupos criolesão e sham. Ao comparamos a quantidade de animais que entraram em SE entre os grupos, observamos que esta foi significantemente maior no grupo Crio+PILO comparado ao grupo Sham+PILO (p<0,05, teste de χ-quadrado), assim como a frequência de animais que apresentaram classe 5 durante o SE (p<0,05, teste de χ-quadrado. Os resultados apresentados neste presente estudo demonstram que a técnica de criolesão, realizada no primeiro dia pós-natal, é capaz de gerar uma resposta inflamatória local além de tornar o animal vulnerável a um segundo estímulo quando adulto.
Doutorado em Medicina (neurociências) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Financiamento:Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco
Resumo
A resposta do estresse é necessária à vida, permite aos organismos, especialmente aos seres humanos, uma rápida adaptação à uma situação de perigo iminente. Entretanto, uma resposta exacerbada, mal coordenada e/ou de duração prolongada pode acarretar efeitos deletérios ao organismo, especialmente ao SNC, levando ao surgimento de doenças e/ou alterando o curso de doenças existentes, como, por exemplo, as epilepsias. Pessoas que vivem com epilepsia relatam que o principal fator precipitante de crises é o estresse, e pessoas que não vivem com epilepsia e passam por situações de estresse intenso tem maior chance de apresentarem crises. Os possíveis mecanismos do efeito próaconvulsivo do estresse ainda é controverso, pois há estudos que demonstraram efeitos anti-convulsivos do estresse. Assim, os objetivos deste trabalho foram: investigar os mecanismos do efeito do estresse crônico, em diferentes fases do desenvolvimento, sobre a susceptibilidade a crises nos animais da cepa Wistar’ Audiogenic’ Rat’ (WAR), bem como sobre aspectos morfológicos associados à epileptogênese utilizando o modelo de crises induzidas por hipertermia em camundongos. Em ratos audiogênicos adultos o estresse crônico de restrição, induzido sempre antes de cada estímulo, mantem o índice de gravidade de crises mesencefálicas (IGCam) severo durante todo o protocolo de kindling audiogênico, fenômeno não observado em animais não estressados. O pré-tratamento com Espironolactona e Mifepristona reverteu o efeito do estresse sobre o IGCam e as latência para corrida selvagem e convulsão tônica. Em camundongos submetidos a crises de longa duração induzidas por hipertermia, e subsequentemente expostos ao protocolo de estresse na vida precoce, foram encontradas diferenças significativas, no hipocampo, para os níveis de expressão de RNA mensageiro para os receptores da corticosterona, na migração ectópica de células granulares para o hilus, na proliferação celular e na neurogênese. Portanto, demostramos que o efeito próaconvulsivo do estresse crônico, em ratos WAR adultos, é mediado pelos receptores de glicocorticóides e mineralocorticóides, sugerindo que a corticosterona tem um papel central neste processo. Ainda, o estresse crônico na vida precoce, promove alterações morfológicas transitórias associadas à epileptogênese (induzida por hipertermia) e alterações persistentes na expressão hipocampal dos receptores da corticosterona.
Doutorado em Fisiologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Financiamento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
As epilepsias são a desordem neurológica mais comum, acometendo entre 1 e 3% da população mundial. Embora a maioria dos casos responda ao tratamento farmacológico, cerca de 30% de todos os pacientes são refratários às drogas sendo, então, candidatos a cirurgia para remoção do foco epileptogênico. Enquanto em adultos a principal causa da necessidade deste tipo de intervenção é a epilepsia do lobo temporal, em crianças são as displasias corticais. Apesar das divergências existentes quanto à classificação das displasias, são achados comuns em exames histopatológicos a desorganização laminar e colunar, a presença de células imaturas, células em balão, neurónios dismórficos e citomegálicos, alteração na conectividade da rede neural cortical, diferenças na estrutura, densidade e afinidade de receptores aos seus ligantes. Ainda não são conhecidos os mecanismos que levam ao surgimento de lesões displásicas, no entanto sabe-se que falhas na proliferação, migração, diferenciação e maturação celular no sistema nervoso durante a vida intra-útero e perinatal promovem o surgimento de lesões displásicas, muitas vezes com características de hiperexcitabilidade levando à ocorrência de crises epilépticas. Experimentalmente é possível induzir a formação de um microgiro cortical a partir do congelamento de pequenas pontos (1 mm²) do córtex de ratos neonatos. Cerca de 7 dias após o procedimento de congelamento cortical o microgiro de 4 camadas está formado com características morfológicas displásicas e hiperexcitabilidade periférica à cicatriz. Apesar de não apresentarem crises espontâneas a exposição destes animais a um segundo insulto (second hit) como febre ou hipertermia leva ao surgimento daquelas, o que torna este modelo uma ferramenta muito útil para o estudo das displasias corticais. A fim de melhor compreender os mecanismos pelos quais o tecido normal se tornadisplásico e hiperexcitável propomos no presente projeto a análise imunohistoquimica de tecidos obtidas a partir do modelo proposto em fase aguda e semi-crônica. Serão avaliadas características morfológicas através da técnica de Nissl, bem como através de ensaios imunohistoquimicos para proteínas tipo celular-especificas a fim de determinarmos qual a provável função daquelas células no contexto de urna circuitaria normal. Desta forma acreditamos ser possível contribuir para a compreensão dos mecanismos que promovem o desbalanço excitação/inibição que leva ao surgimento de hiperexcitabilidade e, finalmente, crise. É conhecido que as lesões displásica são a principal causa de epilepsias infantis refratárias ao tratamento farmacológico, levando à necessidade de intervenção cirúrgica. As principais causas da – emergência deste tipo de lesão variam de fatores puramente genéticos à ambientais ou a somatório de múltiplos fatores. Em roedores é possível modelar tais lesões com o uso de técnicas como a criolesão cortical perinatal, estabelecida como um modelo de geração de microgiria cortical, com hiperexcitabilidade associada, no entanto, sem crises espontâneas. Os mecanismos subjacentes à hiperexcitabilidade encontrada neste modelo ainda não estão estabelecidos, mas é sabido que lesões em laminas corticais profundas, desorientação dos processos celulares, conexões mal formadas nas circuitarias locais e nas projeções tálamo-corticais são cruciais para o surgimento da hiperexcitabilidade. Observando a variabilidade de lesões encontradas em pacientes, para o melhor entendimento de como alterações na circuitaria cortical culminam com a geração de crises, o uso de marcadores celulares especificas tem sido proposto como ferramenta para a caracterização morfológica de lesões displásicas distintas. Neste trabalho foram utilizados 43 filhotes de ratos provenientes do Biotério Central da USPRP, que foram divididos em 30 experimentais e 13 controles. O protocolo consistiu na anestesia por frio pro 12 minutos, exposição da calota craniana e toque de um aparato metálico com três pontos de cantata (1 mm de diâmetro, separados por 1 mm cada) resfriado em Nitrogênio liquido, por dez segundos sobre o osso em formação. Animais controle foram submetidos ao mesmo protocolo, com o aparato metálico em temperatura ambiente. Suturas foram feitas com Dermabond e após reestabelecimento da temperatura corporal os animais foram devolvidos às suas mães. Os animais foram sacrificados dois e seis meses após o insulto inicial, tiveram os tecidos processados para histologia e imunohistoquimica com cortes seriais em 40 micrômetros. Foram feitos ensaios para Neu-N, GFAP, Parvalbumina e ER81 (marcador de lamina V). Coincidentemente com o que ocorre na patologia humana, pudemos observar grande variação anatómica no padrão lesional entre os animais. Assim, fizemos descrições individuais das alterações corticais, com 22/27 (três animais morreram antes do tempo de sacrifício) animais experimentais desenvolvendo lesões displásicas, divididos em leve (10/22), com alterações superficiais na laminação cortical e graves (12/22), com lesões extensas de grande variabilidade nos três eixos. Todas as lesões estão localizadas em córtices motores e somatossensoriais. Animais controle não apresentam sinais de lesão. A análise anatómica do grupo leve mostra que somente laminação superficial foi afetada, sem sinais de formação de microgiro. Foram observadas curvaturas claras em laminas 11/11, sem, no entanto, afetarem laminas profundas ou levarem à invaginação de lamina I. No grupo grave, usualmente foram encontradas invaginações das lamina superficiais com consequente dano às laminas profundas, especialmente lamina V, com formação de cicatriz glial originada de lamina l ou substância branca, variando em forma e tamanho. Há diminuição na expressão de PV em neuropilo no interior das cicatrizes. Diferentemente do usualmente reportado na literatura, nossos animais apresentaram ampla gama de padrões lesionais displásicos, sendo que a formação do microgiro clássico foi um evento raro. A maior parte das lesões não foi continua ao longo do eixo anteroposterior, estando presente como focos de tecido alterado.
Doutorado em Fisiologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Financiamento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
Epilepsia é definida como descargas paroxísticas anormais de populações neuronais em processos que afetam a excitabilidade cortical e do encéfalo como um todo, caracterizando-se pela ocorrência periódicade crises epilépticas, que podem ser conclusivas ou não. Cerca de 1 a 2% da população mundial é portadora de epilepsia e aproximadamente 30 % dos acometidos são resistentes ao tratamento com drogas antiepilépticas e, desses, a maioria apresenta Epilepsia do Lobo Temporal (ELT), que se caracteriza pela ocorrência de crises que se iniciam em estruturas do lobo temporal, como hipocampo, complexo amigdaloide e adjacências. Os pacientes com ELT podem apresentar, Status Epilepticus (SE), que é definido como uma crise de longa duração ou pequenas crises sem recuperação entre elas. No presente estudo foram feitas injeções intra-hipocampais e sistêmicas de pilocarpina (PILO) para indução de SE (ratos e camundongos), mimetizando ELT. Posteriormente foram analisados fenômenos plásticos associados à presença de SE. Os resultados gerados foram subdivididos em capítulos e apresentados abaixo: 1). A injeção de PILO sistêmica (S-PILO) e microinjeção de PILO intra-hipocampal (H- PILO), são capazes de induzir SE e processos neurodegenerativos identificados pela histoquímica de Fluoro-Jade (FJ). Foi observado que áreas FJ+ são mais abrangentes em S-PILO que H-PILO. 2). Foram usados os modelos H-PlLO e microinjeção de extrato bruto de carambola para induzir SE e observou-se que a cinemática de neurodedegeneração FJ+ no grupo carambola foi similar ao encontrado em H-PILO. Os animais foram perfundidos 24 h, 7 e 15 dias após SE e foram mapeadas 5 áreas cerebrais, que são parte da circuitaria hipocampal: Hilus, CA3, CA1, subiculum e córtex entorrinal. Foi observado nos dois modelos (H-Pilo e CA1 7 dias após SE e, apenas no grupo carambola, neurodegeneração mais cedo, no córtex entorrinal 24 h após SE. Posteriormente, foi analisada neurodegeneração apoptótica no Hilus do GD 15 dias após SE e, observou-se também, que o grupo H-PILO possui um maior número de células em apoptose nessa área. Por último, foi feita uma análise em relação à quantidade de novos neurônios na camada granular do GD e foi constatado que o grupo H-PILO também apresentou maior número decélulas novas quando comparado aos animais expostos à carambola. Entretanto, a quantidade de novos neurônios do grupo carambola é maior em relação ao grupo experimental, demonstrando, assim que ocorre neurogênese significativamente maior que o basal. 3). Foram analisadas estruturas de dendritos apicais de células granuladas que expressam green fluorescent protein (GFP), marcadas com Bromodeoxiuridina (BrdU) nascidas 2 meses antes da indução de SE em camundongos C57B/L6. Diferente das células granulares imaturas, as células granulares maduras expostas ao SE (maduras+SE) não tiveram rompimento de sua arborização apical dendrítica, entretanto elas exibiram uma redução significativa na densidade e no número de espinhos dentríticos quando comparadas às células granulares maduras da mesma idade não expostas ao SE (madura/sem SE). 4). Testamos a hipótese de que níveis aumentados de corticosterona (CORT) hormônio relacionado ao estresse, pode aumentar a atividade epileptiforme e o número de crises recorrentes espontâneas (CRE) em camundongos epilépticos induzidos por PILO subcutânea (s.c.). A atividade Vídeo-EEGráficas foi monitorada 24 horas por dia por um período de 4 semanas ou mais, enquanto os animais eram tratados serialmente com CORT e veículo (propilenoglicol) também s.c. A administração de CORT aumentou a freqüência e a duração dos eventos epileptiformes na primeiras 24 horas de tratamento e estes efeitos persistiram por pelo menos 2 semanas após o término das injeções. Injeções de veículo produziram aumento modesto na atividade epileptiforme nas primeiras 24 horas, entretanto, os efeitos na atividade epileptiforme não foram persistentes. A administração de CORT ou veículo não foram capazes de aumentar significantemente a freqüência das CRÊS: embora um pequeno número de animais respondesse de forma exuberante ao tratamento de CORT. 5). Por último foi feito um estudo farmacológico, no qual foi calculada a ‘ED IND.50’ para PILO sistêmica e intra-hipocampal que foi de 174 mg/kg e 2,46 ‘mü’g/kg respectivamente. As doses sugeridas aqui (cerca de 5 ‘mü’g/kg: 1ml de 1200-1400 ‘mü’ /ml de solução de PILO para microinjeção intra-hipocampal e 320 mg/kg para injeção sistêmica) são próximas da metade do padrão de PILO descrita na literatura para ambas as rotasde injeção de PILO. Nossos dados indicam que, para camundongos, a ‘ED IND.50’ é similar a ‘LD IND.50’, sugerindo que não é possível aumentar o número de animais que entram em SE. O conjuntode dados fornece importantes evidências relacionadas aos processos epileptogênicos, indicando as áreas mais acometidas por processos neurodegenerativos e de neurogênese e ainda analisa a influência de estresse sobre as CRÊS. Intervenções neuroplásticas nesta etapa da implementação da síndrome epilética poderão contribuir para o desenvolvimento de terapias antiepiléticas que representarão um passo importante em busca de uma possível cura.
Doutorado em Neurologia/ Neurociências – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Financiamento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
Em humanos, para o melhor entendimento da Epilepsia do Lobo Temporal (ELT), a Neuroetologia foi desenvolvida num grupo de pacientes com ELT mesial unilateral (Dal-Cól et al., 2006) e em seguida, associada a Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT) (Bertti et al., 2010). Enquanto as ELT mesiais foram extensivamente descritas, as ELF ainda representam um desafio para o entendimento de como as crises se originam e também para o tratamento. Em frequência, o segundo maior sítio de anormalidades neurofisiológicas causadoras de crises epilépticas é o lobo frontal. A avaliação dos dados eletrofisiológicos, de neuroimagem e semiológicos são fundamentais nos casos de ELF refratários ao tratamento farmacológico, mas cirurgicamente tratáveis, tanto para localizar de maneira precisa o tecido a ser removido quanto avaliar o prognóstico do paciente após a cirurgia. OBJETIVO: O objetivo do presente estudo é aplicar a análise neuroetológica às crises epilépticas originadas no lobo frontal, identificar a existência de padrões semiológicos e verificar semelhanças ou diferenças entre os padrões encontrados nas crises de ELF. MÉTODOS: Análise comportamental foi desenvolvida em 18 pacientes com ELF através da soma de crises por paciente previamente à lobectomia ou lesionectomia frontal; todos com Engel I após a cirurgia. Os registros de vídeo-EEG foram realizados no Centro de Cirurgia em Epilepsia (CIREP) do HC-FMRP-USP. Os vídeos foram digitalizados e os comportamentos letais anotados segundo-a-segundo. Os dados foram analisados utilizando o programa estatístico ETHOMATIC e apresentados em fluxogramas incluindo frequência, duração, e interação sequencial entre comportamentos. RESULTADOS: Foram analisadas 120 crises de 18 pacientes, 13 do sexo masculino e 5 do sexo feminino. Dados bem estabelecidos na literatura foram confirmados, como a associação com o sono e a rápidarecuperação pós-ictal. Foram observadas crises hipermotoras ou parciais complexas de origem no lobo frontal, crises versivas, crises clônicas focais e crises tônicas (área motora suplementar). Nos fluxogramas, representação gráfica das sequências comportamentais, os eventos motores-complexos, a versão da cabeça e dos olhos, a postura tônica uni ou bilateral, automatismos oroalimentares, o comprometimento da fala e diversas maneiras de vocalização foram identificados com duração e frequência elevados e por vezes contribuíram para fins de lateralização ou localização do foco. Desvio cefálico e facial wiping postictal também estavam presentes, mas sem valor lateralizatório. As associações estatisticamente significativas entre pares de comportamentos (díades) e as novas sequências comportamentais observadas em ELF foram sugestivas também da eventual propagação das crises. CONCLUSAO: A Neuroetologia das crises do lobo frontal permitiu a detecção de tipos semiológicos e de comportamentos com valores localizatórios e lateralizatórios, corroborando dados previamente descritos na literatura, representando uma ferramenta adicional para o estudo das eventuais vias de propagação das crises frontais pela semiologia. Terá impacto futuro ao considerarmos, por exemplo, a associação com exames de EEG ou imagem, ou ainda quando aplicada também a outras patologias cerebrais.
Doutorado pelo programa de Pós Graduação em Bioquímica e Imunologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Financiamento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Co-orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Doutorado pelo Programa de Pós Graduação em Neurociências – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
A CEPA Wistar Audiogenic Rat (WAR) é um modelo genético de crises tônico-clônicas generalizadas. Injeção de ocitocina (OT) na amígdala central (CeA) induz autolimpeza exacerbada em ratos Wistar, um modelo de compulsão. Através deste estudo analisamos o índice de autolimpeza após injeção de OT ou salina (SAL) na CeA e investigamos a associação entre os circuitos de um modelo genético de crise generalizada e compulsão ativados e detectados pela marcação de c-Fos nos núcleos do córtex orbitofrontal, estriado, núcleo paraventricular do hipotálamo, substância negra compacta e riticulada. Disfunções na expressão deste sistema podem explicar algumas das alterações comportamentais apresentadas pelos WAR. O comportamento de autolimpeza exacerbada induzido em WAR pela microinjeção de SAL foi equivalente ao comportamento de autolimpeza exacerbada induzido em ratos Wistar pela microinjeção de OT. Estes dados demonstram que os WAR apresentam uma exacerbação da autolimpeza (um modelo de compulsão) como comorbidade, em concordância com a atividade neuronal pela expressão de c-Fos em núcleos que fazem parte do circuito cortiço-estriado-tálamo-cortical.
Doutorado em Neurologia/Neurociências – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Financiamento: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
Introducão: A cepa Wistar Audiogenic Rat (WAR) é caracterizada pela ocorrência de crises audiogênicas através da exposição aguda ao som de alta intensidade (110 dB) e, entre os circuitos cerebrais envolvidos, acredita-se que o circuito estriado-substância negra reticulada-colículo superior (EST-SNPr-CS) pertença a um sistema anticonvulsivante endógeno, composto por neurônios GABAérgicos, que é capaz de produzir efeitos anticonvulsivos. No entanto, sua ação em crises audiogênicas ainda é muito controversa. Objetivo: O objetivo principal deste trabalho foi estudar o funcionamento do circuito EST-SNPr-CS nos WARs através de injeções de drogas, estudos comportamentais, EEGráficos e anatômicos. Materiais e Métodos: 1) 24 WARs machos formaram 4 grupos e foram injetados sistemicamente com 4 doses de fenobarbital. Através do Índice de Gravidade de crises mesencefálicas categorizado (ISc) analisamos os efeitos anticonvulsivos e através dos scores de ataxia e sedação analisamos os efeitos colaterais das 4 doses. Logo após, 10 fêmeas WARs foram injetadas sistemicamente com a dose ótima de fenobarbital encontrada nos machos e as mesmas análises foram feitas. Um grupo de 6 machos WARs foi implantado estereotaxicamente com eletrodos monopolares nos EST, na SNPr e no CS e foi injetado sistemicamente com a dose ótima de fenobarbital. Foram feitas análises morfológicas e espectrais (transformada de wavelets) nos EEGs, antes, durante e após as crises audiogênicas; 2) Foram implantados estereotaxicamente eletrodos no EST e no CS, um quimetrodo da SNPr direita e 1 cânula de injeção na SNPr esquerda de 14 machos WARs. Dois grupos de 7 animais foram formados sendo um grupo com injeções intranígricas bilaterais de muscimol e o outro grupo com injeções intranígricas bilaterais de fenobarbital. O efeito anticonvulsivo foi avaliado pelo ISc e o EEG dos períodos basais e adaptação foi analisado espectralmente. 3) 15 machos WARs foram estereotaxicamente implantados com eletrodos no EST e na SNPr e 6 animais deste grupo foram implantados com quimetrodo na parte anterior do CS (CSa) e nove na parte posterior do CS (CSp). Em todos os animais foram microinjetados bicuculina e muscimol e a análise do efeito anticonvulsivo foi feito através do ISc. Foi realizada análise neuroetológica dos períodos basal, 1 minuto pré, durante e 1 minuto após a crise audiogênica nos dois grupos, e um novo grupo (n = 7) sem cirurgia foi usado como controle do grupo basal. Os EEGs dos períodos basal, adaptação e crises audiogênicas foram analisados morfologicamente e espectralmente. 4) A neuroanatomia do circuito SNPR-CS foi estudada com a injeção de FluoroGold no CSa de WARs (n = 4) e de Wistar (n = 4) e no CSp de WARs (n = 4) e de Wistar (n = 5). Os neurônios marcados SNPr foram analisados, parte anterior e parte posterior, co-localizados com imunofluorescência para receptores ‘GABA IND. A’. Resultados: Capítulo 1 – a injeção sistêmica de 15 mg/kg de fenobarbital provoca diminuição da oscilação da SNPr e do CS, coincidente com efeito anticonvulsivo dose-dependente em WARs, sem efeitos colaterais. Capítulo 2 – injeções de drogas GABAérgicas (muscimol e fenobarbital) na SNPr não provocam sua inibição, induzem movimentos exploratórios estereotipados e não bloqueiam as crises audiogênicas. Capítulo 3 – o CS em WARs se apresenta em duas porções funcionalmente distintas, CSa e CSp, com diferentes respostas comportamentais e EEGráficas à injeção de BIC e MUS sendo que apenas o CSp participa das crises audiogênicas como um núcleo pró-convulsivo. Capítulo 4 – nos WARs, a SNPr posterior apresenta maior quantidade de neurônios que enviam projeções ao núcleo pró-convulsivo CSp do que a SNPr anterior. Conclusão: A SNPr nos WARs poderia funcionar como um núcleo anticonvulsivo se conseguisse inibir suficientemente o CSp para que este não fosse ativado durante o estímulo sonoro, mas mudanças anatômicas nas projeções dos neurônios entre a parte anterior e posterior da SNPr podem trazer aos WARs uma deficiência do circuito SNPr-CSp, que permite a instalação da crise audiogênica.
Doutorado em Fisiologia – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Resumo
A epilepsia do lobo temporal é a síndrome epiléptica humana mais comum e a mais difícil de controlar com o uso de fármacos. Muitos desses pacientes farmacorresistentes têm que ser submetidos a drásticas intervenções cirúrgicas para a ressecção de grandes áreas cerebrais. A epilepsia do lobo temporal associada à esclerose do hipocampo, denominada epilepsia do lobo temporal mesial, é alvo de intensos estudos clínicos e experimentais.
O hipocampo esclerótico é caracterizado pela morte de neurônios piramidais e pelo brotamento de terminais sinápticos aberrantes ricos em zinco na camada molecular interna e no hilus do giro denteado. Esse brotamento resulta do crescimento de colaterais axonais dos neurônios granulares do giro denteado. Outra mudança fundamental no hipocampo na condição epiléptica é o aumento da neurogênese que ocorre no giro denteado. Essas alterações afetam o padrão de conectividade da formação hipocampal e, portanto, o funcionamento desta rede neuronal.
Modelos animais experimentais foram desenvolvidos para auxiliar na elucidação da patofisiologia dessa condição. O modelo da pilocarpina induz um estado convulsivo sustentado denominado status epilepticus e após um período silencioso, crises recorrentes espontâneas e esclerose hipocampal.
A proteína doublecortin tem sido utilizada recentemente como um marcador de neurônios granulares novos no giro denteado de animais adultos. Sua distribuição citoplasmática permite a visualização e o estudo da arborização dendrítica dos novos neurônios.
Doutorado em Neurologia/Neurociências – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
Um dos modelos experimentais mais utilizados para o estudo da epilepsia é o abrasamento elétrico em ratos, o qual é caracterizado pelo desenvolvimento progressivo de crises comportamentais e elétrencefalográficas em resposta a estimulações elétricas repetitivas, inicialmente subconvulsivas do sistema límbico. No abrasamento convencional, os estímulos são realizados 1 ou 2 vezes por dia, levando aproximadamente 2 semanas para o desenvolvimento do abrasamento, entretanto, intervalos pequenos têm provado ser uma alternativa rápida e eficaz para o estudo das alterações envolvendo a circuitaria neural e suas conseqüências. As principais estruturas envolvidas no início e na propagação das crises epilépticas decorrentes do abrasamento da amígdala são estruturas ricas em zinco. O zinco é um íon muito encontrado nos terminais sinápticos glutamatérgicos, principalmente de estruturas córtico-límbicas. Entretanto a participação deste íon nas sinapses e no desenvolvimento de crises epilépticas é no mínimo conflitante. O principal objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos da quelação de zinco no modelo de abrasamento elétrico rápido da amígdala (ARK), para tanto, foi inicialmente necessário caracterizar melhor este modelo. Dessa forma, ratos Wistar machos foram implantados com eletrodos na amígdala e no hipocampo e foram submetidos ao ARK. Grupos experimentais receberam injeção i.p. do quelante de zinco DEDTC (700 mglkg) ou PBS e foram estimulados. Grupos controles receberam as injeções, porém não foram estimulados. Os estímulos foram realizados na amígdala basolateral (pulso de 1 ms, 60 Hz, 500 ’mü’A, duração de 10 s, intervalos de 30 min) em uma série de 10 estímulos por dia durante dois dias. No terceiro dia foi realizado um estímulo adicional. As injeções foram realizadas antes de cada série de estímulos. Durante todo o protocolo os animais foram monitorados com vídeo-EEG. Três horas após o último estímulo (24 horas após a última série de 10 estímulos), os ratos foram anestesiados profundamente e perfundidos para posteriores análises histoquímicas com o objetivo de verificar brotamento de fibras musgosas (neo-Timm), neurodegeneração (FIuoro-Jade B) e atividade neuronal (cFos). Um grupo adicional de animais submetido ao ARK foi re-estimulado e perfundido um mês após o término do protocolo. Resultados de animais submetidos ao ARK também foram comparados com outro modelo de epilepsia, o Status Epilepticus (SE) induzido por estimulação elétrica da amígdala. O modelo de ARK demonstrou ser eficaz para o rápido desenvolvimento de crises epilépticas e mesmo após um mês sem estimulações houve permanência de seu efeito. O brotamento de fibras musgosas e a degeneração neuronal não são necessários para a ocorrência de crises repetitivas cada vez mais graves e não podem ser induzidos pelo ARK num período curto de tempo. O modelo de ARK é mais ameno que o SE por estimulação elétrica da amígdala, pois apesar de ambos apresentarem semelhanças nas crises comportamentais e nas oscilações sustentadas do EEG, no ARK as crises duram menos tempo e há menor atividade neuronal. O tratamento com quelante de zinco durante o ARK não interfere na progressão das crises comportamentais e nas características de atividade EEGráfica na amígdala e hipocampo, porém diminui o tempo das crises e a freqüência de spikes pós-ictais no hipocampo. Além disso, estruturas que normalmente são ativadas durante o abrasamento apresentam menor atividade na ausência de zinco. Esses dados sugerem que o zinco endógeno pode ter um papel facilitatório no desenvolvimento das crises epilépticas.
Doutorado em Neurologia/Neurociências – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Norberto Garcia Cairasco.
Resumo
A Epilepsia de Lobo Temporal (EL T) é a síndrome epiléptica mais comum na população. Cerca de 50% dos casos de EL T são farmacorresistentes, e a ressecção de lobo temporal leva a 60 a 80% de remissão das crises, e 10 a 20% de melhora significativa. A semiologia é uma importante ferramenta no estudo e diagnóstico das com despertar e aura. Durante a crise, E+D apresentaram sugestão de aura epigástrica, e em ELTD, aura de dor de cabeça. EL TE apresentou fala desconexa no início da crise. Foram encontradas diversas interações entre automatismos de boca e membros, e em alguns casos com distonia ou comportamentos clônicos. A distonia foi contralateral ao foco em ELTE, mas ocorreu tanto contra quanto ipsilateral em ELTD. Não existiram interações diretas entre distonia e comportamentos tônicos ou clônicos. Em E+D o relaxamento do membro superior contralateral ao foco esteve relacionado ao fim da crise. No pós-ictal verificam-se automatismos de membros superiores e coçar a face ipsilateral ao foco em E+D. Como não foram encontradas interações entre distonias e comportamentos tônicos ou clônicos (generalização secundária; GS) nos fluxogramas do período ictal, foram analisadas 91 crises de 55 pacientes, sendo Grupo I) várias crises por paciente (8 pacientes e 44 crises) ou Grupo 11) uma crise por paciente (47 pacientes e crises), para verificar se existe um antagonismo entre a presença de distonia e GS. O Spearman Rank Sum Test evidenciou um Coeficiente de Correlação negativo altamente significativo para ambos os grupos (r=-0,543, p= 0,00245; e r=¬0,571, p<0,001). Não foi encontrada diferença no Student’s T Test ou Mann-Whitney Rank Sum Test na análise das latências para o primeiro comportamento tônico e/ou clônico (p=0,298) e para a crise tônica e/ou clônica generalizada (p=0,382). Também não foi encontrada diferença no tempo total da crise CONCLUSÃO: A Neuroetologia apresentou grande potencial para o estudo semiológico da epilepsia humana. A metodologia foi eficiente para corroborar a literatura e detectar algumas interações ou ausências de interações interessantes durante as crises. O estudo teve um papel importante na validação e padronização da metodologia para epilepsia humana, possibilitando o desenvolvimento de trabalhos clínicos, incluindo a correlação com outros métodos de diagnóstico (EEG, ressonância e SPECT). Verificamos ainda que a distonia e generalização secundária apresentam um padrão antagônico de ocorrência, podendo sugerir que a distoriia seja a expressão da ativação de um circuito anticonvulsivante endógeno.